□プラスミドDNA mini-prepの準備

通常のmini-prep法が適しています。Source BioScience社では下記の方法で行われています。

• 適切な抗生物質を含んだLB寒天培地の上にクローンを蒔き、一晩37℃（amp）または30℃(CM or KM)で培養する。
• LB培地5mlを滅菌済みの50mlチューブに分注し、適切な抗生物質を加える。その培地に単独のシングルコロニーを植菌し、一晩37℃（amp）または30℃(CM or KM)振とう培養する(170rpm)。
• [グリセロールストックを作製する場合は1.5mlマイクロチューブに140?lずつ分注し、40?lの80％グリセロールを加えて混合し、冷凍保存する]
• 2mlの培養液を2mlのマイクロチューブに移し、15分間3000rpmで遠心する。
• 上澄みを捨て、200?lのGTE溶液を加えペレットを懸濁させる。その後RNase A stock (10mg/ml)を5?l加え、10分間室温に放置する。
• 用事調製した0.2M NaOH/1% SDS溶液400?lを加え転倒撹拌した後、氷上に5分間放置する。
• 300?lの3M K Acを加え、転倒撹拌した後、氷上に10分間放置する。
• 10分間13000rpmで遠心し、上澄みを冷やしたエタノール1mlが入った1.5mlマイクロチューブに移す。その後、ボルテックスミキサーで軽く撹拌し、氷上に３０分間放置する。
• 10分間13000rpmで遠心し、エタノールを注意深く取り除く（吸引法を用いるのが望ましい）。
• 冷やしたエタノールを200?l加え、ボルテックスミキサーで軽く撹拌した後、10分間13000rpmで遠心する。その後9.のようにエタノールを注意深く取り除く。
• ペレットを乾燥させた後、50?lのTEを加え、一晩4℃で保存する。

□溶液

10ml GTE:

0.5ml 20% glucose

0.25ml 1M Tris/HCl pH7.5

0.2ml 0.5M EDTA pH8.0

9.05ml 滅菌水

100ml 0.2M NaOH/1% SDS:

0.8 g NaOH

5ml 20% SDS

95ml 滅菌水

□プラスミドDNAのPEG精製（シークエンス解析の前に行うことをお勧めします）

• プラスミドDNA溶液に等量の20％PEG/2.5M NaCl溶液を加え、室温に5縲?襯10分放置した後、10縲?襯15分間13000rpmで遠心する。
• 上澄みを取り除き、ペレットを70％エタノールで洗う。ペレットを乾燥させた後、20?lの滅菌水に溶解させる。
• DNAが回収できているかを確認するため、5?l分注し、 2?lのローディングバッファーを加えてから、適切なDNAマーカーを用いて、1.5％TBEアガロースゲルで電気泳動する。
• シークエンス準備完了

□PCR精製方法

適切なプライマーを使いPCRを行うことで、インサートDNAを増幅させることができます。 PCR産物はシークエンス解析を行う前に、スピンカラムかsAP/exo1法（shrimp alkaline phosphatase/exonuclease1）により精製してください。

□参考文献

• Werle. E, Schneider. C, Renner. M, Volker.M and Fiehn. W. (1994) Convenient single-step, one tube purification of PCR products for direct sequencing. Nucl. Acids Res. 22: 4354-4355.
• Hanke. M and Wink. M. (1994) Direct DNA sequencing of PCR-amplified vector inserts following enzymatic degradation of primer and dNTPs. BioTechniques 17: 858-860.